**||||||||||||||||||| exp03 |||||||||||||||||||||**\\

**fecha=** 22/05/2020 - 25/05/2020\\

**inoculación granos (grain spawn) desde vial de esporas (pftek)**\\

**esporas=** psilocibe cubensis b+ vial de esporas, temperatura deseada de almacenamiento 2-8 grados \\

**receta substrato (grain spawn)**\\

* vermiculita
* harina de arroz integral (hecha moliendo granos de arroz integral)
* yeso (gypsum)\\


**dimensiones del proyecto para monotub granos y fibra de coco (cálculos iniciales)**\\

* caja de fructificación = 35,5 x 23,5 x 18 cm = 9 lt\\

contenido= 35,5 x 23,5 x 7,5 = 6256,88 cc = 25 tarros de 250 cc\\

proporción= 1:1\\
* 1/2 fibra de coco = 13 tarros\\
* 1/2 inoculum Vr/BRF/Gy miceliado por B+  = 12 tarros\\

**tarros reales usados para la inoculación**\\

* 6 x 250 cc
* 4 x 236,59 cc
* 4 x 118,29 cc\\ 

* total inoculum —> 2919,16 cc
* total coco —> 3250 cc 
* total mezcla —> 6169,16 cc \\

* nota: si al momento de la mezcla no hay suficiente inoculum disponible, la ratio puede ser 2:1 (FC/IN)\\

+ yeso/Gy 2tsp  (teaspoon) 10 ml\\

cada 20gr de coco seco = 1 tarro de coco hidratado


**procedimiento**\\

* preparación tarros: coger unos tarros (mejor una medida pequeña, con boca ancha y no alargados para que la aguja pueda llegar al medio del substrato) y hacerles cuatro agujeros en la tapa; se puede usar un clavo y un martillo (//fotos//).\\  

 
**preparación INOCULUM:**\\

ratio 2 (Vr) : 1 (BRF) : 1 (H2O) + 2tsp de yeso\\

esto sería 1500 cc : 750 cc : 750 ml\\

en tarros 6T : 3T : 3T\\

* notas:

- La primera mezcla ha salido demasiado húmeda, al ponerla en los tarros se producían wet spots. Para mejorar la mezcla, he agregado 2 tarros más de vermiculita, 1,5 de BRF y 1/2 tsp de yeso.\\ 
- Han salido 2 tarros más de sustrato de 500 y 400 cc respectivamente.\\ 


**esterilización del substrato**\\

* método de esterilización= **esterilización fraccional o tyndallización**\\

* hervir los tarros en una olla con 5/7 cm de agua, poner en el fondo un trapo para que no se quemen. todo esto por 30 min y por 3 días consecutivos. durante el día, dejar cubierto con tapa a temperatura ambiente.\\ 

* nota= este método asegura la esporulación de posibles bacterias resistentes al calor, las que una vez esporuladas, vienen eliminadas en las esterilizaciones sucesivas.\\

- 1a esterilización 22/05/2020 22h (aprox), repetido cada 24h por 3 días\\ 
- última esterilización 24/05/2020 22h\\


**inoculación desde vial de esporas b+ (LC) de 10ml**\\

* inyectar 1/4 de cc por cada agujero de las tapas de los tarros = 1ml x tarro\\

se han noculado: 10 tarros:\\
* 4 de 198,29cc
* 4 de 236,59cc
* 2 de 250 cc\\


**Observaciones sobre la técnica:**\\

* antes de empezar aprender como usar bien jeringa y vial (presión, llenado, etc.)\\
* esterilización herramientas entre tarros, ojo a esterilizar bien, pero sin perder material\\
* la glove box que hemos construido no es lo más cómodo, posición de los brazos y guantes muy apretados a la hora de trabajar, no da mucho márgen de movimiento\\
* revisar mejor la esterilización del espacio, mesa, etc. (para no tener sustos!)\\
* movimientos, cada cosa en su lugar, separar los tarros, las herramientas, el vial. proceder con orden y manteniendo el protocolo de limpieza. cuidado a donde se apoyan las herramientas para evitar esterilizaciones (alcohol y llama) innecesarias\\ 
* el tamaño de la aguja que venía con el vial, no llegaba al fondo de los tarros más alargados. en este sentido, mejor usar tarros más pequeños (198,29cc) o conseguir una aguja más larga\\
* ojo con las condiciones de miceliación: lab, temperatura etc….


**resultado =** parcialmente conseguido\\

*estado de los micelios a día 12/09/2020\\ 

de los tarros inoculados:\\
- los de 198,29cc están completamente miceliados\\
- los de 236,59cc el micelio había empezado a crecer pero se ha estancado (*posibilidad de que esté contaminado por dentro?)\\
- los de 250cc hay una presencia de micelio que pero no ha crecido en manera considerable. el sustrato se nota particularmente seco\\

los tarros no inoculados se han contaminados todos\\

*Update tarros 01/11/20\\
- los de 236,59cc, tres contaminados. uno se ha colonizado de blanco pero no estoy segura si es micelio de b+ o algún otro competidor (cobweb? o algún moho blanco?)\\
- los de 250cc, todos contaminados (mohos o bacterias, wetdrops y olor ácido).